Лабораторія біології стовбурових клітин:2
Вивчення механізмів регенерації тканин за участю дорослих стовбурових клітин та апоптозу як основного регулятора клітинного гомеостазу.
Група під керівництвом Ігоря Пруднікова.
Використовуючи модель субтотального радіаційного ураження в експериментальних щурів, ранійше, ми встановили, що мезенхімальні стромальні клітини людини (hMSCs) здатні відновлювати функціональні можливості ендотеліальних клітин судин, пошкоджених радіацією. При цьому, не було виявлено слідів донорських клітин у судинах реципієнтів, що свідчить про ендокринний або паракринний характер цього ефекту. Ці експерименти можна описати детальніше так. Ефект внутрішньовенного введення людських мезенхімальних стромальних клітин (hMSCs) оцінювали шляхом вимірювання активності кальцій-залежних калієвих каналів великої провідності (BKCa) у гладеньком’язових клітинах (ГМК) грудної аорти, отриманих від щурів із нефатальним опроміненням усього тіла. Опромінення спричинило значне підвищення артеріального тиску та зниження ацетилхолін (ACh)-індукованих релаксаційних реакцій у опромінених щурів порівняно з контрольною групою. Одночасні вимірювання скоротливої сили та внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Ca²⁺]i) показали, що чутливість міофіламентів до Ca²⁺ зростала після опромінення. Внутрішньовенне введення hMSCs ефективно відновило струм BKCa та амплітуду ACh-індукованої ендотелій-залежної вазодилатації в судинних тканинах постопромінених щурів. Введення hMSCs нормалізувало підвищений артеріальний тиск і чутливість міофіламентів до Ca²⁺ у опромінених тварин. У здорових щурів hMSCs не впливали на ці показники. Дослідження не виявило імуногістохімічних доказів приживлення hMSCs у щурів-господарів. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) показала, що hMSCs негативні на маркери гемопоетичних клітин і позитивні на маркери hMSCs. Протягом 30-денного експериментального періоду клінічних ознак реакції «трансплантат проти хазяїна» не спостерігалося. Отримані дані свідчать про виражену здатність hMSCs нормалізувати судинну функцію, порушену радіацією. Подібні ефекти спостерігалися в інших патологічних моделях, зокрема генетично зумовленій артеріальній гіпертензії та цукровому діабеті.
Electrophysiological and contractile evidence of the ability of human mesenchymal stromal cells to correct vascular malfunction in rats after ionizing irradiation. A Soloviev, I Prudnikov, V Tsyvkin, S Tishkin, S Kyrychenko, S Zelensky, Irina Ivanova. The Journal of Physiological Sciences, 2010, v. 60 (2), P. 161-172; V.
Human mesenchymal stem cells as a potential therapeutic approach to vessel function recovery in genetically determined arterial hypertension and diabetes mellitus. Ivanova, K. I. Klimenko, I. V. Kizub, I. M. Prudnikov*, V. N. Tsyvkin*, A. I. Soloviev. Journal of Ukrainian Academy of Medical Sciences, 2013, т. 19, № 3.
Таким чином, фізіологічні експерименти з вивчення впливу дорослий стовбурових клітин на нормалізацію різних патологічних станів поглибили наше розуміння їхньої ролі в забезпеченні життєздатності тканин. Ми дійшли висновку, що ці ефекти зумовлені механізмами, які включають екзосоми — везикули, що генеруються стовбуровими (та іншими) клітинами під час ендоцитозу. Продовженням цієї теми було дослідження механізмів поширення сигналів, генерованих стовбуровими клітинами. Ми досліджували можливості поширення сигналів клітинної загибелі за участю активованих каспаз-3 або -7. Виявлено, що стовбурові клітини кісткового мозку дорослої людини не здатні до апоптозу за участю цитохрому c та каспаз. Проте їхні прямі нащадки — нейтрофіли — генерують активовану каспазу-3, яка присутня в екзосомах. Ці екзосоми можуть локально передавати сигнали в місцях пошкодження судин або тканин або поширювати активовану каспазу-3 по всьому організму.
Apoptosomes and proteasomes from exosomes generated by human hematopoietic stem cells. I Prudnikov, A Smirnov, V Tsyvkin, 2021, Proceedings 75 (1), 2;
Human hematopoietic stem cells generate exosomes containing active proteasomes but not caspases IM Prudnikov, VM Tsyvkin, AM Smirnov, IV Pristash. Фізіологічний журнал, 2020, 66 (6), 13-20;
Extracellular proteasomes I Prudnikov, V Tsyvkin, A Smirnov, I Pristash, M Syrko. Фізіологічний журнал 2020, 66 (5), 73-84.
Таким чином, фізіологічні процеси — від регенерації до клітинної загибелі — мають механізм поширення функціональних сигналів через екзосоми як їхні носії.
Ми також досліджували моделі, які дозволяють вивчати реакції власних дорослих стовбурових клітин організму. Однією з таких моделей є нервові стовбурові клітини в корі головного мозку риб. У відповідь на травму ока в нервовій системі риб активуються сплячі стовбурові клітини, що запускає регенерацію, яка супроводжується появою нових нейрональних і гліальних клітин із пулу нейробластів дорослих стовбурових клітин. Мозок риб має унікальну особливість хребетних — він зростає разом з організмом протягом усього життя. Це робить риб модельним об’єктом для вивчення ембріонального та постембріонального розвитку центральної нервової системи (ЦНС) і впливу на ці процеси різних чинників. У мозку дорослих хребетних зберігається система прогеніторних клітин, активність яких забезпечує поповнення популяції нейронів і гліальних клітин протягом тривалого часу після народження. Механізми пре- та постнатального морфогенезу мозку в риб, які тривалий час зберігають личинковий стан, залишаються маловивченими. Під час постембріонального розвитку в костистих риб деякі нейротрансмітери та газоподібні медіатори (зокрема оксид азоту [NO] і сірководень [H2S]) виступають як чинники, що ініціюють і регулюють клітинні та тканинні процеси генетичної програми розвитку мозку. Нейробласти в перивентрикулярній ділянці мозку вивільняють гамма-аміномасляну кислоту (ГАМК), забезпечуючи негативний зворотний зв’язок щодо проліферації стовбурових клітин і регулюючи розмір пулу нейробластів. Ми припускаємо, що в мозку риб існує потужний механізм контролю продукування нейробластів. Класичні нейротрансмітери (ГАМК, катехоламіни) і газотрансмітери (NO та H2S) не лише регулюють функціональну активність нейронів і модулюють синаптичну передачу в зрілих нейронних мережах, але й діють як морфогенетичні чинники в постембріональному онтогенезі мозку риб. Наявність ферментів, що синтезують газотрансмітери, у ділянках мозку, які експресують ядерний антиген проліферативних клітин (PCNA), підтверджує їхню роль у регуляції постембріонального нейрогенезу. У теленцефалоні молодих особин лосося масу (Oncorhynchus masou) виявлено поверхневу перивентрикулярну проліферативну зону з PCNA-позитивними (PCNA+) клітинами, що відповідає паліальній перивентрикулярній зоні (PVZ) інших видів риб, включно з її дорсальним, латеральним і медіальним компартментами. PCNA+ клітини також ідентифіковано в паренхімі інтактного мозку лосося масу, з максимальною концентрацією в медіальній зоні. Після механічної травми в теленцефалоні з’являються зони індукованого нейрогенезу — нейрогенні ніші та ділянки вторинного нейрогенезу, оточені радіальними гліальними волокнами. PVZ паліуму молодих особин лосося масу містить кластери недиференційованих HuCD-позитивних (HuCD+) нейронів. У пошкодженому теленцефалоні спостерігається зміна топографії HuCD+ клітин, зокрема поява нейрогенних ніш у латеральній зоні та зростання щільності розподілу й міграції клітин у медіальній зоні. Ці дані свідчать, що пластичність мозку зберігається у формі повернення до ембріонального або раннього постнатального стану.
GFAP expression in the optic nerve and increased H2S generation in the integration centers of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) brain after unilateral eye injury EV Pushchina, AA Varaksin, DK Obukhov, IM Prudnikov Neural Regeneration Research 2020, 15 (10), 1867-1886;
Proliferation, Adult Neuronal Stem Cells and Cells Migration in Pallium during Constitutive Neurogenesis and after Traumatic Injury of Telencephalon of Juvenile Masu Salmon, Oncorhynchus masou. EV Pushchina, EI Zharikova, AA Varaksin, IM Prudnikov, VN Tsyvkin. Brain Sciences, 2020, 10 (4), 222.
Подальше вивчення апоптозу як ключового регулятора клітинного гомеостазу під час онто- та ембріогенезу спонукало нас переглянути класичну схему його функціонування в нормальних (не онкогенних) стовбурових клітинах. Ми дослідили утворення апоптосом, індуковане 2′-дезоксиаденозин-5′-трифосфатом (дАТФ) і цитохромом c, як надійний і природний процес запрограмованої клітинної смерті в мозку новонароджених щурів. Ми намагалися з’ясувати, які чинники спричиняють нелінійне зростання утворення апоптосом на початковому етапі їхнього складання. Виявлено, що стимуляція складання актину речовинами, такими як рибонуклеаза А (РНК-аза А) або катіони (Na⁺ чи K⁺), індукує утворення апоптосом. Інгібітор полімеризації актину цитохалазин D перешкоджає цій стимуляції. Ми вперше показали, що організація апоптосом безпосередньо пов’язана з цитоскелетом, і пропонуємо вважати бета-актин ключовим регулятором утворення апоптосом, включивши його до переліку білків, критичних для запрограмованої клітинної смерті. Досліджуючи можливу функціональну взаємодію актину з цитохромом c, ми використали мічення амінокислотних залишків очищеного b/g-актину з мозку щурів у мономерній формі (G-актин) флуоресцентним барвником 3-(4-карбоксибензоїл)хінолін-2-карбоксальдегідом (CBQCA) для моніторингу конформаційних змін у білковій молекулі. Ми виявили утворення іншого флуоресцентного деривату під час реакції цього барвника з фенольною групою вільного тирозину та його залишків у пептидах і білках незалежно від наявності ціаніду. Дослідження конформаційних змін у молекулах такого міченого G-актину показало, що інтенсивність флуоресценції змінюється в тій частині спектра, яка характерна для продукту реакції з залишком тирозину (але не з його аміногрупою). Зокрема, цитохром c у мікромолярному діапазоні концентрацій дозозалежно знижував флуоресценцію міченого G-актину, що вказує на його пряму взаємодію з G-актином. Таким чином, за допомогою раніше не описаного мічення CBQCA залишків тирозину ми дослідили конформаційні зміни в молекулі актину та встановили його зв’язок із цитохромом c. Ми припускаємо, що актин відіграє роль регулятора утворення апоптосом, зокрема через взаємодію з цитохромом c.
The Actin Cytoskeleton Is a Key Element of the Apoptosome Assembly in the Developing Brain Proceedings. Prudnikov, A.M. Smirnov, V.M. Tsyvkin. 2021, 75(1):8923 DOI: 10.3390/Cells2020-08923;
DYNAMICS OF CONFORMATIONAL CHANGES IN FLUORESCENTLY LABELED G-ACTIN UPON INTERACTION WITH CYTOCHROME C AS EVIDENCE OF POTENTIAL INVOLVEMENT OF CYTOSKELETAL PROTEINS IN APOPTOSIS I.M. Prudnikov, A.M. Smirnov, V.M. Tsyvkin. Fiziol. Zh. 2024; 70(6): 55-62.
